Electroforeza proteinelor serice

Principiul  metodei

 Electroforeza  este  procesul  de  separare  a  componenților  unui  amestec  prin migrarea diferită, în  câmp electric continuu, a  particulelor  încărcate  electric,  fără  a  se  descarca  la  nivelul  electrozilor,  conform:

– Proprietăților  particulelor  (sarcina electrică – natură și valoare, masă, ramificații)

– Proprietăților  mediului de migrare (natură, concentrație)

– Condițiilor  experimentale  (intensitate curent electric, tensiune,  pH, temperatură etc.)

 Kit-ul (DDS  Diagnostic SRL, Bucuresti, Romania) conține:

-10 folii cu gel de agaroză

– flacoane soluție tampon

– flacon soluție colorant concentrat

– flacoane soluție decolorant

– set folii de plastic cu fante

– bucăți hârtie filtru

Modul de lucru este indicat în instrucțiunile kit-ului. Este important să existe în dotarea laboratorului și materialele solicitate prin kit, dar defurnizate de acesta (alcool etilic, apa distilata, pipete automate specifice, cilindru gradat)

Preparare reactivi

1. Pentru obținerea soluției tampon, utilizată în procesul de electromigrare, se diluează conținutul flaconului corespunzător cu apă distilată, în proporție de 1:9.

2. Pentru obținerea colorantului de lucru, se dizolvă conținutul flaconului din kit cu apă diluată, in proporție de 1:1.

3. Apoi, se realizează soluția de fixare, care va conține etanol, acid acetic glacial si apă distilată, în cantitățile precizate pe instrucțiunile kit-ului,anume 4,5 :1 :4,5.

4. Soluția de decolorare se obține prin amestecarea conținutului din flaconul corespunzător cu apă distilată, în proporție de 1:29.

Mod de lucru

– Inițial, se realizează diluarea serului pacienților în raport 1:6, cu sistem tampon.

– Se scoate folia cu gel, fără a se atinge suprafața gelului.

– Se aplică banda de hârtie de filtru în zona în care se vor depune serurile și se îndepărtează imediat ce s-a umezit.

– Se  aplică folia de plastic cu fante pe  zona semiuscata și se preseaza ușor pe toată  lungimea.

– Se aplică 3,5 microlitri ser diluat pe  fiecare  fantă și se lasă până la absorbția  completă a serurilor în gel.

– Pe fanta cu probă de testat se poate pipeta opțional și albastru de bromfenol. Deoarece acest compus are o viteză de migrare asemănătoare cu cea a albuminelor, migrarea acestui colorant oferă posibilitatea de a observa deplasarea probei de albumine în camera electroforetică și oprirea procesului înainte ca proba să ajungă la electrod.

– Se  îndepartează  folia  cu  fante  de  pe  gel.

– Se introduce soluția tampon de migrare în cuva electroforetică.

– Se introduce folia cu gel în cuva de migrare, ținând cont de polaritatea camerei electroforetice și indicațiile de pe folie (anodul este polul pozitiv si spre acesta vor migra fracțiile proteice).

– Se acoperă cuva de migrare cu capacul și se alimentează camera electroforetică la tensiunea indicată, reglându-se și timpul specificat în instrucțiuni. În cazul prezentat în acest material, recomandarea pentru utilizarea  sistemului este de a utiliza o tensiune de  82V pentru o migrare de 10 min.

– După migrare, se deconectează sursa de current electric continuu, se scoate folia și se introduce în  baia de fixare, timp de10 minute.

– Ulterior, folia se usucă, apoi se introduce în baia de colorare aproximativ 3-4 minute, după care se decolorează, prin mai multe spălări succesive cu soluția pentru decolorare și se usucă din nou

-Se realizează analiza calitativă și cantitativă a fracțiilor separate prin scanarea rezultatului:

        • albumine

        • alfa 1 globuline

        • alfa 2 globuline

        • beta 1 globuline

        • beta 2 globuline

        • gama globuline.

Bibliografie

Coman Gh., Badea M., Elemente de chimie analitica, Editura Universitatii Transilvania din Brasov, Brasov, 2015